PRÁCTICA 6: ROSA DE BENGALA

OBJETIVO

El Rosa de Bengala es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de Ac anti-Brucela en suero humano. La suspensión bacteriana y coloreada, es aglutinada por Ac IgG o IgM presentes en el suero del paciente.

FUNDAMENTO

El diagnostico de la brucelosis puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre o heces, o por la demostración de la presencia de Ac específicos en el suero del paciente, que es el que vamos a hacer en este caso. El reactivo, debido a su formulación en un tampón ácido, es capaz de reaccionar con IgG o IgM, por lo que es muy útil para el diagnostico de individuos en fase crónica de la enfermedad, los cuales presentan un nivel elevado de IgG difícilmente detectables por el método tradicional de aglutinación en tubo (Wright)
Es decir, sirve de screening.

REACTIVOS

• Rosa de Bengala: suspensión de Brucella abortus cepa S99, en tampón lactato
• Control + (rojo): Suero animal, con Ac anti Brucella   >  50UI/mL 
• Control - (azul): Suero animal. Conservante.
• En esta práctica no usamos suero sanguíneo por no tener, así que realizamos la prueba con un control +

Material:

• Micropipeta y puntas
• Vaso para desechos
• Tarjeta con fondo blanco

PRECAUCIONES:

• Respetar la conservación y estabilidad de los componentes como respetar fecha de caducidad, mantenerlos a una temperatura indicada, no congelar, siempre en posición vertical, etc.

PROCEDIMIENTO:

Método cualitativo:

Depositamos 50 µL de control positivo y otros 50 de control negativo sobre un círculo distinto de la tarjeta

Luego se agita el reactivo de Rosa de Bengala vigorosamente y se deposita una gota sobre la del control +.

Luego se mezclan ambas gotas con un palillo realizando círculos hacia el exterior ocupando toda la superficie del círculo.

Tras ello agitamos la tarjeta suavemente durante cuatro minutos, con cuidado de no sobrepasar el tiempo para que no de un mal resultado.

Se observó la aglutinación

Resultados de los controles positivo y negativo

Método semicuantitativo:

Luego se realizó el método semicuantitativo en el cuál se añaden 50 µL de solución salina en cada uno de los círculos y luego 50 µL del suero de paciente (control +) en el primer circulo solamente, tras ello homogeneizamos y pasamos 50 µL al segundo círculo (con la micropipeta siempre inclinada para evitar burbujas) y así hasta el ultimo donde se desecha el ultimo volumen de paso.

Dispensando 50 uL de solución salina

Añadiendo Rosa de Bengala

Resultado

Como se puede ver, se observa así mejor la

aglutinación que con simple vista. El título es 4

Tras ello se deposita una gota de látex en cada uno de los círculos y se mezclan con un palillo (usando siempre palillos distintos).

Tras ello lo dejamos reposar 4 minutos.

A continuación se pudo observar solo aglutinación en el primer y segundo circulo, por lo que el título sería 4.

Cabe añadir que se veía muy levemente y tuvimos que usar un contador de colonias para hacer de lupa y así observar mejor la aglutinación

Debemos saber que el título es la inversa de la máxima dilución donde hay aglutinación.

Entonces para obtener la concentración multiplicamos por el factor que nos viene indicado, que en este caso es 25.

25 x Título de PCR= X UI/mL

25 x 4 = 100 UI/mL