PRÁCTICA 10: INMUNOGLOBUINA M POR TURBIDIMETRÍA

19.11.19

OBJETIVO

 Realizar esta técnica para su uso en anticuerpos IgM, los Ac anti - IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio en su absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.

FUNDAMENTO

La IgM es la única Ig que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% de Ig. Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de Ig. La IgM aumenta en infecciones víricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria...

Material necesario:
  • Gradillas
  • Tubo
  • Micropipetas y puntas
  • Baño termostatizado
  • Espectrofotómetro
Reactivos
  • Diluyente (R1)
  • Anticuerpo (R2)
  • Protein Cal
  • Muestra


PROCEDIMIENTO

Preparamos primero una batería de diluciones y rotulamos los tubos del 1 al 6 y dispensamos con la pipeta primero las siguientes cantidades de solución salina: 

  • Tubo 1 100 µL
  • Tubo 2: 90 µL
  • Tubo 3: 75 µL
  • Tubo 4: 50 µL
  • Tubo 5: 25 µL
  • Tubo 6: sin solución salina




Tras realizar esto lo siguiente fue pipetear calibrador en los mismos tubos de la siguiente forma y siempre homogeneizando y cambiando punta de pipeta tras ello.

  • Tubo 1: sin calibrador
  • Tubo 2: 10 µL
  • Tubo 3: 25 µL
  • Tubo 4: 50 µL
  • Tubo 5: 75 µL
    •
  • Tubo 6: 100µL



Tras realizar esto medimos la absorbancia de cada uno de estos tubos para obtener la curva de calibración de IgM
Los valores fueron los siguientes:

  • Tubo 1: 0.214
  • Tubo 2: 0.219
  • Tubo 3: 0.224
  • Tubo 4: 0.251
  • Tubo 5: 0.275
  • Tubo 6: 0.289







 Tras realizar esto cogemos otros 6 tubos y los rotulamos y dispensamos en cada uno de ellos 800 µL de R1 y seguidamente del tubo 1 de la anterior se cogen 10 µL y se depositan en el tubo 1 de la batería nueva y así sucesivamente hasta el tubo 6. Es muy importante homogeneizar y cambiar de punta.




Volvemos a realizar las medidas de absorbancia y los resultados fueron:
  • Tubo 1: 0.241
  • Tubo 2: 0.316
  • Tubo 3: 0.467
  • Tubo 4: 0.580
  • Tubo 5: 0.703
  • Tubo 6: 1.341
Una vez obtenemos ambos datos hay que restar los valores de estas absorbancias por el de las anteriores en cada uno de los tubos y así podemos saber que cantidad hay, además luego hay que realizar la gráfica y para ello necesitamos saber de la concentración de la IgM que ya nos viene en el protocolo el cual tenemos que multiplicar por el factor. Y esta será la concentración de los tubos.
Tras realizar todos los cálculos los resultados obtenidos fueron los siguientes y además realizamos una curva de calibración en excell.



 Por último, realizamos la medida de muestras a las cuales tuvimos que meterlas un rato en el baño porque estaban congeladas, para realizar la medida cogemos dos tubos de ensayo y ponemos en el primero el R1 en la misma cantidad que el anterior y ponemos 10 µL de muestra, ese paso lo realizamos con las muestras 1 y 2. Se homogeiniza y se mide la absorbancia, los resultados fueron:
  • Muestra 1: 0.552 
  • Muestra 2: 0.403
 Luego le añadimos R2 ( Ac de cabra que actua como Ag para nosotros) le añadimos 200 µL, esperamos 2 minutos y procedemos de nuevo a la lectura, los resultados fueron:
  • Muestra 1: 0.856
  • Muestra 2: 0.602
Restamos las absorbancias y obtenemos:
  • Muestra 1: 0.344 
  • Muestra 2: 0.403
Una vez realizado esto nos vamos a la gráfica y extrapolamos los datos, la muestra 1 sale aproximadamente 110 mg/dL y la muestra 2 sale aproximadamente 60 mg/dL. Pero si lo queremos hacer con exactitud lo podemos realizar con la fórmula que nos ha dado excell y sale lo siguiente:
  • Muestra 1: 106 mg/dL
  • Muestra 2: 63.62 mg/dL

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