PRÁCTICA 12: INTERACCION AG-AC. PROCEDIMIENTO DE OUCHTERLONY

10.12.19

OBJETIVO

Introducir los principios de las interacciones Ag-Ac usando el procedimiento Ouchterlony.

FUNDAMENTO

La doble difusión en dos dimensiones es un procedimiento simple inventado por Orjan Ouchterlony. Las soluciones de Ag y Ac se colocan en pocillos separados cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pozos uno hacia el otro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único Ag se combinará con su Ac homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos Ags están presentes, cada uno se comporta independientemente el uno del otro. Por lo que el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de Acs y Ags presentes.

Material necesario:

Micropipeta y puntas
Placas de Petri
Baño termostático
Microondas
Probeta
Vaso de precipitados
Pipeta pasteur
Gradilla
Tubos eppendorf

Reactivos:

Antisuero (Ac)
Suero total (Ag)
Albúmina (Ag)
IgG (Ag)
Agarosa

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de Ag y Acs (alícuotas para los grupos)

Un grupo de clase nos dispusimos unos días previos a repartir las alícuotas para los grupos, para ello se rotulan 9 tubos eppendorf con A otros 9 con B, 9 con C y 9 con D.

Seguidamente se ponen 100 μL de muestra A (antisuero) en los tubos A.

Se alicuotaron 200 μL de muestra B (suero total) en cada tubo B.

Luego 150 μL de albúmina en cada tubo C

Y finalmente 80 μL de IgG en cada tubo D.

Alícuotas para toda la clase.

2. Preparación de agarosa.

Lo primero que hicimos fue encender el baño termostático para que alcanzase la temperatura necesaria al momento de poner la agarosa.

Para ello medimos 225 mL de agua destilada en una probeta y lo vertemos a un vaso de precipitados de 500 mL, seguidamente le echamos todo el contenido del componente E (tampón en polvo) y agitamos hasta disolverlo totalmente. Rotulamos con rotulador la línea hasta donde alcanza la agarosa para luego rellenar en caso de que se evapore.

Tras ello depositamos todo el contenido del paquete de Agarosa y agitamos también hasta disolver

Seguidamente fuimos al microondas donde calentamos un total de 150 segundos (hasta que la agarosa se veía transparente).

Lo pusimos en el baño hasta alcanzar una temperatura de 55º C.

3. Preparación de las placas de Ouchterlony

Cada grupo necesita 3 placas, pero un grupo se dedicó a rellenarlas todas, para ello con ayuda de una micropipeta depositamos 5 mL de agarosa en las placas de Petri hasta acabar la agarosa totalmente, nos dio para aproximadamente 40 placas.

Tras echar la agarosa en la placa es importante observar que no haya burbujas y si las hay se deben romper con una punta de pipeta antes de que solidifique.

Se dejan reposar hasta que se solidifiquen y se rotula con el grupo en el lateral de la placa para poder luego identificarlas.

4. Preparación de los pocillos para las muestras.

Una vez solidificada la agarosa nos valemos de plantillas para realizar la perforación de los pocillos, para realizar los pocillos se realizó cortando un extremo de la pipeta pasteur para hacerlo más grueso y se presiona la pipeta, se rompe la agarosa haciendo el pocillo, se suelta y se saca hacia arriba con lo que conseguimos succionar el trozo de agarosa para realizar el pocillo. Se realizaron 5 pocillos en cada una de las 3 placas del grupo.

5. Carga de las muestras en los pocillos.

Es diferente en cada placa, pero el volumen será siempre 30 μL, lo primero que hicimos fue con la misma punta de pipeta añadir esos 30 μL de antisuero (tubo A) en los pocillos centrales.

Luego hicimos lo siguiente:

En la placa 1 (que la rotulamos previamente) dipusimos en todos los otros pocillos 30 μL de suero entero (tubo B).
En la placa 2 se dispusieron 30 μL de suero entero (tubo B) en los pocillos superior izquierda y en inferior derecha y luego 30 μL de albúmina en los otros dos.
En la placa 3 se disponen 30 μL de IgG en el pocillo superior izquierda y en el inferior derecho, y 30 μL de albúmina en los otros dos.

NOTA: Es muy importante rotularlos por la parte lateral al lado de cada pocillo con la letra correspondiente para luego saber que es. Además del número de placa y el grupo.

6. Incubación.

Luego se colocaron las tapas en las placas y se colocaron con cuidado en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. Luego se cubrió con papel de aluminio y se dejó incubar a temperatura ambiente entre 24 - 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación.

OBSERVACIÓN DE RESULTADOS:

En la placa número 1 vimos como se formaron las líneas de precipitación que indican que muchos sistemas Ac-Ag están visibles, es de identidad total