PRÁCTICA 4: Serodiagnostico de la toxoplasmosis por hemoaglutinacion indirecta
15.10.19
OBJETIVO
Con esta práctica vamos a determinar tanto cualitativa como semicuantitativo de anticuerpos séricos dirigidos contra toxoplasma gondii por hemoaglutinación indirecta.
FUNDAMENTO
Los hematíes sensibilizados están constituidos por hematíes de ovino recubiertos por un antígeno toxoplasmatico.
Nos permite detectar IgG y IgM antitoxoplasmaticas.
La presencia de anticuerpos anti-toxoplasma gondii séricos provoca aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo/marrón rojo.
En ausencia de Ac específicos , estos hematíes sedimentan en el fondo del pocillo formando un anillo.
Nos permite detectar IgG y IgM antitoxoplasmaticas.
La presencia de anticuerpos anti-toxoplasma gondii séricos provoca aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo/marrón rojo.
En ausencia de Ac específicos , estos hematíes sedimentan en el fondo del pocillo formando un anillo.
Los hematíes no sensibilizados aseguran la especificidad de la reacción y permiten eliminar las interferencias debidas a las aglutininas naturales anti-ovino (heteroanticuerpos de Forssman, Ac de mononucleosis infecciosa)
Composición del equipo
- Hematíes sensibilizados (origen animal)
- Hematíes no sensibilizados (origen animal)
- Tampón fosfato pH 7,2
- Control positivo titulado (origen animal)
- Control negativo (origen animal)
- 2 microplacas en forma de U por grupo
Material necesario:
- Micropipeta y puntas (50 o variable)
- Contenedor para desechos
- Tubos de ensayo y tapones
Precauciones:
Agitar cuidadosamente las suspensiones antes de su uso.
PROCEDIMIENTO
1. Lo primero que vamos a hacer es preparar una dilución madre del suero a analizar (1/40).
Para ello depositamos en un tubo de ensayo con una pipeta 1,95 mL de tampón fosfato y 50 uL de suero.
El suero lo hemos puesto en un tubo eppendorf previamente.
El suero lo hemos puesto en un tubo eppendorf previamente.
2. Seguidamente suspendimos en una placa microtiter 50 uL de tampón fosfato en 8 pocillos de la microplaca.
3. Dispensar 50 uL de la dilución madre en el primer pocillo y transferimos hasta el sexto, desechando el volumen de paso de este. Es decir, realizamos una batería de dilución.
4. Tras ello dispensamos 50 uL de dilución madre en el séptimo pocillo y mezclamos con el tampón, luego desechamos 50 uL. Esto se realiza como suero control, el cual tiene el objetivo de detectar aglutininas naturales anti-ovino (Ac de Forssman) que pueden contener ciertos sueros y ello nos llevaría a un falso positivo. En el caso de que salga positivo debemos tratar el suero con adsorbente y realizar de nuevo el mismo proceso descrito (aunque ese no fue el caso porque nos dio negativo)
5. Luego agitamos cuidadosamente las suspensiones de hematíes, en nuestro kit se designaban así:
- R1: Hematies sensibilizados
- R2: Hematies no sensibilizados
- R3: Adsorbente (que no usamos)
Tras la agitación lo que hicimos fue añadir R1 a los primeros 6 pocillos y al numero 8. El pocillo ocho controla la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados.
NOTA: No se prepara más que un único reactivo control para cada serie de pruebas.
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| Muestras de suero |
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| Dispensando tampón fosfato en los 8 pocillos |
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| Añadiendo dilución madre en el primer pocillo |
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| Hematíes sensibilizados |
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| Hematíes no sensibilizados |
NOTA: No se prepara más que un único reactivo control para cada serie de pruebas.
Luego añadimos R2 al pocillo 7 (el suero control).
Tras esto homogeneizamos de forma cuidadosa el contenido de los pocillos golpeando lateralmente la microplaca pero manteniendola plana
Lo dejamos reposar 2 horas tapado con parafilm.
La hora exacta: 10:04 h
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| Placa tapada con parafilm |
Pasadas esas dos horas procedimos a la lectura (a las 12:04).
Observamos que los dos primeros pocillos no contenian el anillo que se forma al fondo del pocillo pero los demás si, a excepción del numero 7 por lo que la muestra no tenía Ac de Forssman, y el 8 dio negativo por lo que el tampón es válido.
Cabe añadir que el título sería 160 por que esa dilución en ese pocillo es 1/160.
Además para determinar la existencia de IgM se trata con 2- mercaptoetanol (pero como no teníamos no se pudo realizar). Con esto y tras añadirle 140 uL de 2 ME y 10 mL de tampón fosfato, luego se añadiría 50 uL de esta solución a los 6 pocillos de la microplaca. En caso de que nos diera el mismo título quiere decir que no hay IgM, si disminuye el título, indica que si hay IgM.
Con estos datos y dado que en el caso de que el suero es positivo hasta 1/320, el umbral de sensibilidad es de 0,1 UI/mL, el título será entonces de 160 x 0,1 = 16 UI/mL.
Con esto llegamos a la conclusión de que con este título hay presencia de Ac anti-toxoplasma, por lo que se hubiese recomendado el tratar con 2 ME para ver si hay presencia de IgM, pero debería bajar el título al menos 2 diluciones.
Con estos datos y dado que en el caso de que el suero es positivo hasta 1/320, el umbral de sensibilidad es de 0,1 UI/mL, el título será entonces de 160 x 0,1 = 16 UI/mL.
Con esto llegamos a la conclusión de que con este título hay presencia de Ac anti-toxoplasma, por lo que se hubiese recomendado el tratar con 2 ME para ver si hay presencia de IgM, pero debería bajar el título al menos 2 diluciones.
OBSERVACIONES:
Es muy importante saber que cuando se realiza la titulación del suero del paciente por aglutinación en ausencia de 2-ME y se informa un título, lo que de verdad se está informando es de una actividad aglutinante que es la suma de la actividad aglutinante de la IgM y la IgG
Es muy importante saber que cuando se realiza la titulación del suero del paciente por aglutinación en ausencia de 2-ME y se informa un título, lo que de verdad se está informando es de una actividad aglutinante que es la suma de la actividad aglutinante de la IgM y la IgG
TABLA RESUMEN ACLARATORIA
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| Realizamos todo menos los 2 controles. |
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