PRÁCTICA 11 ESTREPTOLISINA O LIOFILIZADA

27.11.19

OBJETIVO

El objetivo va a ser determinar la presencia de ASLO a través de una inhibición de la hemaglutinación.

FUNDAMENTO

 La SLO iofilizada es un purificado de estrep. ꞵ hemolíticos. Es un producto estandarizado para la determinación cuantitativa del título de ASLO.  Diluciones crecientes del suero problema se enfrenta con una cantidad constante de SLO. en presencia de hematíes O (ya que están libres de Ag).
Nosotros realizamos el micrométodo.

Material necesario:
  • Placa microtiter
  • Micropipetas y puntas
  • Pipeta
  • Eppendorfs
  • Tubos de ensayo
  • Gradilla
Reactivos:
  • Tampón fosfato isotónico, pH=6
  • Suero.
  •  Hematíes O.
  •  SLO

PROCEDIMIENTO

Nuestro grupo se encargó de realizar alicuotas para toda la clase en tubos eppendorfs.
Además tuvimos que rehidratar la SLO con 15 mL de agua, para ello me serví de una pipeta eché el agua destilada, homogeneizando y luego agitando suavemente.

También realizamos la dilución del paciente con las posteriores alícuotas para la clase, para ello hicimos lo siguiente:

- A un tubo de ensayo se rotuló con 1/10: A
- A otro se rotuló con 1/25: B
Las cuales van a ser las diluciones que contengan.
En el tubo A echamos 0,2 mL de suero y 1,8 mL de tampón.
En el tubo B echamos 0,1 mL de suero y 2,4 mL de tampón.

Luego en la placa microtiter realizamos lo siguiente:
  • Rotulamos correctamente fila A y fila B y en los primeros 10 pocillos de la A y la Bechamos 50 μL de solución tampón.
  • Luego echamos suero al 1/10 en el primer pocillo y realizamos una batería de dilución hasta el noveno pocillo donde se desecha el último volumen de paso. (igual en ambas filas)
  • Seguidamente echamos 25 μL en 10 pocillos de SLO en la fila A, en la B solo en 9 porque el control de hematíes que vamos a realizar debe ser positivo, al contrario de lo que ocurre en la fila A que es un control de SLO y por lo tanto es negativo.
  • Acto seguido movemos un poco e incubamos la placa a 37 ºC durante 15 minutos en la estufa.
  • Cuando acabó dicho tiempo:
  • Echamos 25 μL de hematíes al 3% en los 10 pocillos en  las dos filas. 
  • Y volvemos a meter en estufa 45 minutos a 37 ºC pero a los 15 minutos lo sacamos y lo movimos un poco. 
  • Transcurrido el tiempo lo dejamos 1 hora a temperatura ambiente y ya se procedió a la lectura.
Mezclando SLO con agua destilada





Metiendo placa en estufa

LECTURA:

El título de SLO corresponde a la inversa de la mayor dilución de suero en cuyo tubo no se detecta hemólisis en el sobrenadante.
El resultado fue en la fila A un título de 80 y en la fila B un título de 100, debido a las diluciones de las máximas concentraciones.



OBSERVACIONES

Se debe tapar con parafilm los pocillos cuando los metamos en la estufa.

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