PRACTICA 13: INMUNOELECTROFORESIS

17.12.19

OBJETIVO

Separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de albúmina e IgG

FUNDAMENTO

La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteinas) que atraviesan dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo a recorrido electroforetico y se rellena con un Ac antiproteina adecuado.

La difusión del Ag y del Ac permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

Material necesario:

• Cubeta de electroforesis y fuente de alimentación.
• Probeta de 1L y de 250ml
• Matraz erlenmeyer
• Embudo
• Placa de Petri
• Portaobjetos
• Pautas para perforar pocillos

Reactivos:

• A: IgG
• B: Suero saguineo
• C: Albúmina
• D: Acs frente al suero
• E: Ac frente a la IgG
• F: polvo de agarosa

PROCEDIMIENTO

Preparación del tampón y gel de electroforesis

Lo primero que hicimos fue echar 40 mL del tampón de electroforesis del bote en 960 mL de agua. Para ello nos valemos de una probeta grande de 1L y lo mezclamos bien con una varilla.

Seguidamente añadimos 1 gramo de agarosa en 100 mL de tampón de electroforesis ya preparado. Con una probeta medimos el tampón y luego mezclamos con el tampón en un matraz erlenmeyer. Y luego lo metemos en el microondas hasta que quede transparente. Seguidamente enfriamos la agarosa a 60°C en el baño termostático y una vez a esa temperatura lo vertemos en el molde.

Rápidamente antes de que solidifique ponemos el molde que hemos elaborado con placas de petri y portaobjetos para crear los carriles.

Cuando el gel solidifica se extrae cuidadosamente el molde para los carriles.
NOTA: Es importante que al sacar el molde del gel no quede ningún resto de agarosa sobre el carril, en caso de haberlo se quita con alguna punta de pipeta.

Realización de electroforesis

Primeramente se hicieron los pocillos con ayuda de la pajita dejando una distancia aproximadamente de 0.5 cm. Se eliminó la agarosa de los pocillos con ayuda de un objeto punzante.

Luego se colocó la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y se dispuso papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior.

Luego se vertió el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta hasta llenarlos y nos aseguramos que el papel de filtro que sobresalía de los extremos del gel de agarosa estaba sumergido en el tampón.
NOTA: No se debe cubrir el gel con el tampón.

Luego dispensamos 20 μL de cada Ag (A,B y C) en los pocillos correspondientes:

• A en el superior
• B en el central
• C en el inferior. 

Es importante cambiar las puntas entre Ag y Ag

Seguidamente se cerró la cubeta y se conectaron los electrodos respetando la polaridad y teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.

Luego se conectó la cubeta a la fuente de alimentación y se aplicó un voltaje de 125V durante 1 hora.

Una vez transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de alimentación y se quita la tapa de la cubeta, se retiró el papel de filtro y se extrae de la cubeta la bandeja con el gel.

Difusión de los Ag y Ac

Se añadió 50 μL de cada Ac al carril que correspondía y se dispensa procurando que se distribuyese por todo el carril, luego se colocó la bandeja con el gel en una cámara húmeda, y tras 24-48 horas serán visibles los arcos de precipitación en el gel.

Pasado dicho tiempo observamos en un contador de colonias, y se puede apreciar como se formó un halo alrededor de los carriles.